送樣須知

常見送樣問題：

1.血漿（plasma）還是血清(serum)？

對于大多數涉及到Exosome RNA分離的研究，我們推薦使用血漿（plasma）。因為血清收集后在凝血過程中，血小板受到刺激會產生許多Exosome和其他形式的小泡，因此血清中獲得的小泡始終比血漿中多，甚至超過50%的小泡來源于血小板。所以血漿是研究病理生理狀態下Exosome更好的介質。多數的criculating Exosome研究樣本使用的是血漿。負壓采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因為有壓力激活效應，并且被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速。顛倒混勻采血管8-10次，與管壁上的抗凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動。離心前管子應該垂直存放，并記錄實驗室中存放的時間，因為從采血到離心除去細胞和血小板這中間的過程很重要，建議在30min內完成，長時間的存放，而沒有及時處理會導致血小板細胞Exosome的進一步釋放。血液要盡快處理，在室溫條件下分離血漿（或者血清）。所有樣品要使用相同的轉速和轉子類型離心。

2.怎樣選擇抗凝劑（anticoagulant）？

抗凝劑有一個或多個形式的功能,包括螯合鈣、蛋白酶抑制和抑制血小板活化。有許多抗凝血劑可用，但不建議使用肝素（heparin）抗凝劑。無論是外源性或內源性起源（例如肥大細胞），肝素會抑制下游PCR反應，因為肝素會與引物和酶競爭與核酸結合。另外,肝素可抑制Exosome與靶細胞的結合,抑制Exosome激活血小板或降低血小板激活閾值。應用肝素治療的病人也應該注意。對于珍貴樣本，可能需要從肝素化的血液樣品中提取RNA。核酸的檢測需要通過調整PCR的敏感性。另外如果Exosome相關核酸被發現只存在于Exosome內,在RNA分離之前的洗滌也可以幫助去除肝素。其它抗凝劑如EDTA、氟化鈉/草酸鉀(NaF/KOx),或檸檬酸三鈉[加入/不加右旋糖dextrose(ACD)或茶堿(theophylline)、腺苷(adenosine)和雙嘧達莫(CTAD)]就更復雜了，最好根據下游的實驗來指導。CTAD阻礙血小板活化和隨后的Exosome釋放。EDTA可干擾PCR反應(盡管程度低于肝素),但它的存在可能是無害的。另外,下游實驗的選擇需要考慮到抗凝劑的使用種類。不同的聚合酶對抑制劑有不同的敏感性。

3.靜脈取血過程應該注意什么?

在血液處理過程中，由于物理作用力，血小板中的Exosome容易在處理過程中釋放，這些外力包括：接觸、壓力、剪切力，所以標準化的樣品處理，需要統一的注射器型號以及其他操作。使用21號針頭或者更大號的針頭可以避免靜脈取血剪切力引起的不良效應。負壓采血之后，血液首先存放入采血管，去除止血帶，最初的幾毫升不要，因為有壓力激活效應，并且被成纖維細胞污染。血液收集應該輕柔并且迅速顛倒混勻采血管8-10次，與管壁上的抗凝劑混合，但不要為了抗凝而劇烈搖動。

4.樣本受晝夜節律，采血時間和飲食狀態的影響嗎？

血液學參數在人體的一天之中是有變化的，血液粘稠度的輕微變化在幾十年前就已發現。最近發現，晝夜節律對于血小板的激活具有很大的影響，而且比壓力（包括鍛煉身體）的影響還要大。白細胞穿梭以及在促炎癥因子和抗炎癥因子在血液循環中存在也在一天當中有變化。因此，對于Exosome的研究，在實驗設計上，需要有嚴格的對照，采血時間在晝夜節律上的一致才能更容易的比較樣本差異。此外，還需要考慮，樣本來源人體在正常睡眠/蘇醒周期上的差異性。食物對于Exosome的影響目前還不知道，但是因為脂蛋白載著RNA，食物的吸收影響血液循環中脂蛋白顆粒的類型、數量和功能，因此采血可以在飯后一個統一的時間點進行，進食記錄也是很有價值的。

5.還需要額外的數據收集嗎?

來自血液其他數據對于分析病理生理作用也是很有意義的，有時可能還需要分離其它細胞如白細胞或者血清游離DNA/RNA作為Exosome的對照，有時需要流式細胞術配合抗體對細胞分選或分析，確定血液細胞組分的比例。血中Exosome可能來自其他組織器官，有時需要從同一個患者身上得到多種體液與血液進行對比，例如腦脊液(CSF)和血漿樣本。

6.溶血是否影響結果？

一般溶血樣本通過顏色就可以看出來，如果必要可通過分光光度計和血紅蛋白釋放實驗測量。當分析總exRNA，溶血的血液制品含有高濃度的特定RNA，其中包括miR-16和miR-451等，還有待確定RNA以這種方式釋放是否會干擾exRNA分析結果。

7.血液樣本需要記錄哪些信息？

國際細胞外囊泡學會(International Society for Extracellular Vesicles, ISEV)推薦記錄如下信息：

采血時間

采血針的類型/其他配件

抗凝管的類型

起始棄去的血液有多少？止血帶是否移除迅速？

采血時間和離心時間間隔有多久？

處理注意事項（樣本是否保持垂直？是否室溫存放？）

是否溶血和檢測方法？

樣本處理細節（轉子類型、離心力、離心時間）

樣本分裝細節和存放

細胞是否分離？

全血計數？

流式檢測？

是否還進行其他血液檢測？

是否有匹配的其他樣本收集（比如血漿和血清，尿液，鼻液，口水等）

是否有病人親屬樣本作為對照

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